Việc phát hiện sớm và chẩn đoán kịp thời có ý nghĩa rất quan trọng trong điều trị nhằm hạn chế tử vong và dị chứng cho trẻ. Khi có các dấu hiệu nghi ngờ kể trên, thầy thuốc sẽ thực hiện các xét nghiệm xác định chẩn đoán như công thức máu, CRP, điện giải đồ, đường máu, cấy máu và quan trọng nhất là chọc dich não tủy để xét nghiệm sinh hóa và vi sinh.

Chọc dịch não tủy là thủ thuật quyết định chẩn đoán. Chọc dich não tủy sẽ được thực hiện bởi các thầy thuốc. Đây là một thủ thuật vô trùng và xâm nhập. Vị trí chọc dịch não tủy hay sử dụng nhất trên lâm sàng là vùng cột sống thắt lưng ngang mức L4. Dụng cụ là một cây kim chuyên dụng, sắc và có nòng. Kim được đưa vào khoang dịch não tủy để lấy dịch não tủy. Dịch não tủy sẽ được đánh giá bằng mắt thường và xét nghiệm hóa sinh cũng như vi sinh.

1. Bằng mắt thường có thể đánh giá sơ bộ tính chất vật lý của dịch não tủy. Thông thường dịch não tủy trong như nước suối. Khi bị viêm màng não mủ thì tùy theo giai đoạn mà màu sắc thay đổi khác nhau từ màu ám khói, đục như nước dừa, đục như nước vo gạo đến mủ rõ ràng. Việc đánh giá này cũng rất quan trọng để quyết định điều trị kháng sinh sớm trước khi có kết quả xét nghiệm chắc chắn.
2. Xét nghiệm hóa sinh thường sẽ đo nồng độ glucose, protein, lactate, clo, CRP... Nồng độ glucose trong dich não tủy thường bằng từ 1/2 đến 2/3 nồng độ glucose máu lấy đồng thời với lúc chọc dịch não tủy trong điều kiện bệnh nhân chưa được truyền đường trước đó. Nếu nồng độ glucose dịc não tủy thấp hơn 1/2 nồng độ đường máu lấy đồng thời được gọi là hạ. Đôi khi nồng độ glucose trong dịch não tủy giảm chỉ còn dạng vết hoặc không định lượng được. Protein trong dịch não tủy thường thấp hơn 0,25 g/L. Trong trường hợp viêm màng não mủ thì lượng protein tăng cao, đôi khi rất cao đến 5 hoặc 10 g/L.
3. Xét nghiệm vi sinh dịch não tủy nhằm đánh giá lượng tế bào bạch cầu và sự hiện diện của vi khuẩn trong dịch não tủy. Thường dịch não tủy chỉ chứa 3 - 5 tế bào trong một milimét khối và đa phần là tế bào lympho. Trong viêm màng não mủ, tế bào tăng cao vài trăm đến vài nghìn, đôi khi trên chục nghìn, đa phần là tế bào đa nhân trung tính và các tế bào này ở dạng thoái hóa mủ. Xét nghiệm tìm vi trùng thực hiện nhanh bằng nhuộm Gram và soi kính hiển vi. Xét nghiệm này cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn hay không, hình thái như thế nào và cách bắt màu thuốc nhuộm. Cũng có thể dùng các kháng thể để phát hiện các kháng nguyên hòa tan trong dich não tủy. Dịch não tủy cũng được đem cấy để định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ. Các phòng xét nghiệm tiên tiến có thẻ làm thêm các xét nghiệm tìm virus như virus viêm não Nhật Bản B, enterovirus, herpes virus, parvovirus... nếu nghi ngờ viêm não do virus.